【酵母菌种发酵设备，活性干酵母投资生产线技术转让】

（一）目的

 了解发酵罐的结构，掌握小型发酵罐灭菌及发酵条件的控制。

 了解啤酒酵母菌生长代谢的基本规律。

（二）原理

实验室所使用的小型通气搅拌发酵罐具有体积小，耗电少，不易染菌，位时间、单位体积的生产能力高，代谢放出热量易于移去，操作控制和维修方便等特点，因此能较好地满足微生物生长和代谢的需要。

（三）器材

30L发酵罐（郑州欧世博生物工程公司，型号：SGJ）、检查无菌用的各个阶段的培养基和装置

（四）内容与步骤

  (1)实验内容

        1、啤酒酵母的种子培养

     2、发酵罐各种配件的安装

    3、培养基的消毒处理

    4、发酵工艺的调控

    5、发酵产物的分离及菌种浓度测定

       （2）实验步骤

       1.前期准备工作
       ( 1 ) 发酵罐的清洗 发酵罐使用前后都应认真清洗，特别是前后两次培养采用不同的菌株时，更应注意清洗和杀菌工作。
发酵罐内可进行清洗的任何部分都应认真清洗，否则都可能成为杂菌的滋生地。易被忽略而未能充分清洗的地方有喷嘴内部与取样管内以及罐顶等处。
      ( 2 ) 种子培养基及培养条件

种子培养基：蔗糖25g/L，尿素3g/L，KH2PO4 10g/L,MgSO4 2.5g/L,微量元素10 ml/L，维生素液15ml/L，pH 5.0

发酵培养基：（NH4）2SO4 15g/L，KH2PO4 8.0g/L，MgSO4 3.0g/L,微量元素液 10 ml/L，消泡剂 0.3ml/L，ZnSO4 0.4g/L.

流加培养基：KH2PO4 9.0g/l,MgSO4 2.5g/L,K2SO4 3.5g/L,NaSO4 0.28g/L,蔗糖500g/L

微量元素：在1L溶液中含有EDTA15g，znso45.75g，Mncl20.32g,Cuso40.50g,Cocl20.47g,Na2MoO40.48g,Cacl22.9g,Feso42.8g,121℃湿热灭菌20min待用。

维生素：在1L溶液中含有维生素H0.05g，泛酸钙1.0g，烟酸1.0g，肌醇25.0g,对氨基苯甲酸0.2g，硫胺素1.0g，吡哆醇1.0g。

②培养条件：用接种环从保存斜面中接一环至装液量为200ML的1000ML摇瓶中， 250r/min,30℃ ，摇瓶培养24h。

3发酵过程在30℃，pH5.0下进行 ，搅拌速度为300rpm。通气量50L/h.
( 3 ) 发酵罐的组装工作 （由于此步骤发酵罐已安装完毕只需了解）
①连接好冷却水管 采用自来水冷却，连接部要充分牢固，并且注意连接管管径与自来水管管径应一致，尽可能采用耐压管。
②由于通入的空气有一定压力，应注意连接压缩空气的管子应能承受一定压力。③安装pH及溶解氧等检侧装置,注意各接线口不要出现差错。由于操作过程要和水打交道，故线路连接一定要注意安全，要特别注意防止漏电。

( 4 ) 发酵罐灭菌
①排气管为硅胶管,一端装有过滤装置，以保证蒸汽能自由出入发酵罐，同时不会出现染菌现象．
②取样口上连接一段硅胶管，在硅胶管上安装节流夹，以防止培养基在灭菌时流出。
③装入发酵罐容积60％的培养基后，通入高压蒸汽加热发酵罐,在121℃下灭菌20min。当灭菌完成后，确认排气口正常后，以0.3~5L/min的通气量通入过滤气体．接通冷却水管脚开挽拌在低转速下进行培养基的冷却．

2.酵母菌培养

（1）接种操作

接种是在发酵罐顶部接种口进行。适当降低通风量，在接种口四周缠绕上经酒精浸泡的脱脂棉，点燃后戴上石棉手套,迅速打开接种口，将菌种加入到发酵罐中，接种量为10％，然后将接种口盖子在火焰中灭菌后盖好。开始培养。

（2）培养初始阶段应注意的事项

培养初始阶段是易出现故障的阶段，因此在这段时间里，有必要再次确认并保证发酵罐及相关装置的正常运行。特别注意接种前后发酵罐仪器显示屏上数据和所取样品的分析，以及pH,温度和气泡等的变化。并进行适当补料。
（3） 培养中的注意点

要注意蠕动泵运转中自于硅胶管的弯曲折叠，出现的阻塞现象以及水的渗漏等问题。特别需要注意在一定的阶段泡沫有可能大量生成。每次取样有必要进行检查。
（4） 培养完成时的操作

 培养完成时，除取出足够量的培养液作为样品外，剩余培养液要经过灭菌处理。此时发酵罐所装有的电极可一同经灭菌处理。如果培养液为无害物质，可将电极单独取出处理，以利于延长电极使用寿命。

3.取样与分析方法
     自培养操作开始起，每3h取一次样。取样时将取样管口流出的初15mL左右培养液作为废液，取随后流出的培养液10mL,在OD505下测定吸光度和细胞湿重来监控不同时间点的菌体生长情况。所得数值基于已制得的菌体量与吸光度之间的关系曲线，换算出菌体浓度。
4.结果的整理
以时间为横坐标，OD值等为纵坐标做图。 

（五）实验要求

     1、学生在实验操作过程中自己动手独立完成，10人1组。

     2、完成综合性实验报告：     

（1）小型发酵罐的操作记录；

（2）发酵参数的记录，绘制参数的动态曲线；

（3）分离方法的参数记录，产物及菌种含量的记录。

（六）实验设备

生物显微镜、发酵罐、灭菌锅等。